TIANSeq HiFi anplifikazio nahasketa

Liburutegia anplifikatzeko PCR aurrez nahasketa, liburutegi errendimendu handiarekin, fideltasun handikoa eta oinarri txikiarekin.

TIANSeq HiFi Ampli fi cation Mix fideltasun handiko PCR anplifikazio aurremixka berria da, errendimendu handiko sekuentziazio liburutegiaren PCR anplifikaziorako eta PCR lotutako beste klonazio eta detekzio baterako egokia dena. Aurrez nahastutako disoluzioan Ultra HiFi DNA Polimerasa fideltasun handiko DNA polimerasa mota berri bat da, eboluzio molekular zuzenduaren teknologiak garatua, DNA polimerasak plantilekiko duen afinitatea hobetzen duena. Entzima honek anplifikazio abiadura eta hedapen gaitasuna hobetu ditu eta PCR eta produktuen etekinen arrakasta tasa handitu da. Entzimak 3'-5 'exonukleasa jarduera bikaina du (Zuzentze-jarduera), eta bere fideltasuna merkatuko produktu nagusien mailara iritsi daiteke, geneen eta liburutegiaren anplifikazio-prozesuaren benetakotasuna bermatuta. Gainera, produktuaren DNA polimerasak HotStart funtzioa du, tenperatura baxuetan anplifikazio ez-espezifikoa eta entzimaren jarduera galtzea modu eraginkorrean kontrolatu ahal izateko, horrela PCR anplifikazioaren espezifikotasuna eta egonkortasuna bermatuz. PCR erreakzioaren hobekuntza sistema bat ere integratuta dago Mix-ean, nahasketaren egonkortasuna hobetzeaz gain, polimerasaren tolerantzia PCR erreakzio inhibitzaileekiko tolerantzia hobetzen du, baina baita Ultra HiFi DNA Polimerasaren egokitasuna GC eduki desberdinak dituzten txantiloietara egokitzeko ere. produktuak laginaren unibertsaltasun zabala eta laginaren sarrerako tartea dituela eta PCR erreakzioaren oinarrizko lehentasuna minimizatzen duela.

Katua. Ez Enbalatzeko neurria
4992369 1 ml
4992370 5 × 1 ml
4992371 5 * 1ml
4992372 5 * 1ml

Produktuaren xehetasuna

Adibide esperimentala

ohiko galderak

Produktuen etiketak

Ibaian behera

NGS liburutegia PCR anplifikazioa, 1. belaunaldiko sekuentziazioko PCR anplifikazioa, fideltasun handiko klonazioa, SNP detekzioa, gunearen berariazko mutazioa, etab.

Ezaugarriak

■ Eraginkortasun handiko anplifikazioa: bihurketa tasa ziurtatu eta anplifikazio zikloak murriztu.
■ Lehentasun txikia: anplifikazio eraginkortasun orekatua GC% eduki desberdineko DNA txantiloientzat.
■ Zehaztasun handia: HotStart propietatearekin eta zehaztasun handiarekin.
■ Fideltasun handia: fideltasuna Taq DNA polimerasa baino 50 aldiz handiagoa da.
■ Sentsibilitate handia: txantiloien sarrera 1 orrialde artekoa izan daiteke.

Produktu guztiak ODM / OEMrako pertsonaliza daitezke. Xehetasunak lortzeko,mesedez sakatu Zerbitzu pertsonalizatua (ODM / OEM)


  • Aurreko:
  • Hurrengoa:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental Example 1. Irudia. ADN genomikoaren liburutegia GC erlazio desberdinekin aberastea (sarrera genomikoa 10 ng, 8 zikloko anplifikazioa) aldi berean burutu zen K eta N hornitzailearen TIANSeq HiFi anplifikazio nahasketa eta HiFi entzima erabiliz, eta liburutegiaren errendimendua Agilent-ek detektatu zuen. 2100. Emaitzek erakutsi zuten TIANSeq HiFi Amplification Mix liburutegiaren errendimendu handia duela, GC eduki desberdinetarako unibertsaltasun handia duela eta liburutegia aberasteko errendimendua beste hornitzaile batzuek baino hobea zela.
    Experimental Example Datuak sekuentziatzeaErabili TIANSeq HiFi anplifikazio nahasketa eta HiFi entzima bereziki hornitzaileak K eta N hornitzaileen NGS liburutegia anplifikatzeko erabilitako DNA genomiko bereko liburutegia anplifikatzeko (genomaren sarrera 10 ng da). Sekuentziatu ondoren, aztertu liburutegiaren estaldura eta bikoizketa tasa.
    GC lehentasunaExperimental Example 2. Irudia. Amplifikatu genoma liburutegiak CG eduki desberdinekin TIANSeq HiFi Amplification Mix eta HIFi hornitzaileak erabiliz K eta N. Emaitzak erakusten du TIANSeq HiFi Amplification Mix anplifikazio liburutegiaren uniformetasuna ona dela eta GC hobespenik gabea, emaitzen baliokidea dena. K konpainiarenak eta N. konpainiaren produktuak baino zertxobait hobeak Emaitzek erakusten dute TIANSeq HiFi Amplification Mix anplifikazio liburutegiaren estaldura handia dela, bikoizketa tasak baldintzak betetzen dituela eta liburutegiaren anplifikazio errendimendua lehiakideen parekoa dela.
    G: Zein da zatien tamainen banaketa orokorra NGS liburutegian?

    Gaur egun, errendimendu handiko sekuentziazio teknologia batez ere hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologian oinarritzen da. Hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologiaren irakurketaren iraupena mugatua denez, luzera osoko sekuentzia zati txikien liburutegietan zatitu behar dugu sekuentziatzeko. Sekuentziazio esperimentu desberdinen beharren arabera, normalean sekuentziazio bakarreko edo bikoitzeko sekuentziazioa aukeratu ohi dugu. Gaur egun, hurrengo belaunaldiko sekuentziazio liburutegiko DNA zatiak, normalean, 200-800 bp bitarteko tartean banatzen dira.

    excel
    G: Eraikitako liburutegiaren DNA kontzentrazioa baxua da.

    a) DNAk kalitate eskasa du eta inhibitzaileak ditu. Erabili kalitate handiko DNA laginak entzimen jarduera inhibitzea ekiditeko.

    b) DNA lagin kopurua ez da nahikoa DNA liburutegia eraikitzeko PCRrik gabeko metodoa erabiltzen denean. Zatikatutako DNAren sarrera 50 ng baino gehiago denean, PCRrik gabeko lan-fluxua modu selektiboan egin daiteke liburutegia eraikitzeko prozesuan. Liburutegiaren kopia kopurua baxuegia bada zuzenean sekuentziatzeko, DNA liburutegia PCR bidez anplifika daiteke egokitzailea ligatu ondoren.

    c) RNA kutsatzeak hasierako DNA kuantifikazio zehaztugabea ekartzen du RNA kutsadura DNA genomikoaren purifikazio prozesuan egon daiteke, eta horrek DNA zehaztugabea kuantifikatzea eta DNA karga nahikoa ekar dezake liburutegiaren eraikuntzan zehar. RNA kendu daiteke RNase-rekin tratatuz.

    G: DNA liburutegiak banda anormalak erakutsi zituen elektroforesiaren analisian.

    A-1

    a) Zati txikiak (60 bp-120 bp) agertzen dira Zatiki txikiak egokitzaile zatiak edo egokitzaileek osatutako dimeroak izan ohi dira. Agencourt AMPure XP alea magnetikoekin arazketak egokitzaile zati horiek modu eraginkorrean kendu eta sekuentziazio kalitatea bermatu dezake.

    b) Pieza handiak liburutegian agertzen dira PCR anplifikazioaren ondoren. Liburutegiaren DNA zatiaren tamaina 120 bp handituko da egokitzailea ligatu ondoren. Egokitzailearen loturaren ondoren ADN zatia 120 bp baino gehiago handitzen bada, gehiegizko PCR anplifikazioaren zatitxo anormalaren anplifikazioak eragin dezake. PCR zikloen kopurua murrizteak egoera ekidin dezake.

    c) Liburutegiko DNA zatien tamaina anormala egokitzailea ligatu ondoren Kit honetako egokitzailearen luzera 60 bp da. Zatiaren bi muturrak egokitzaileetara lotzen direnean, luzera 120 bp-tan handituko da. Kit honek eskaintzen duen beste egokigailu bat erabiltzen baduzu, jarri harremanetan hornitzailearekin egoki den luzera bezalako informazioa emateko. Mesedez, ziurtatu esperimentuaren lan-fluxuak eta eragiketak eskuliburuan azaldutako urratsak betetzen dituztela.

    d) Egokitzailea ligatu aurretik DNA zatiaren tamaina anormala Arazo honen arrazoia DNA zatitzean erreakzio baldintza okerrek eragin dezakete. Erreakzio denbora desberdinak erabili behar dira DNA sarrera desberdinetarako. DNA sarrera 10 ng baino gehiago bada, 12 minutuko erreakzio denbora optimizatzeko abiapuntu gisa aukeratzea gomendatzen dugu, eta une honetan sortutako zatien tamaina 300-500 bp bitartekoa da batez ere. Erabiltzaileek ADN zatien luzera handitu edo txikitu dezakete 2-4 minutuz beren eskakizunen arabera, beharrezko tamainarekin DNA zatiak optimizatzeko.

    A-2

    a) Zatikatze denbora ez da optimizatzen Zatikatutako DNA txikiegia edo handiegia bada, kontsultatu erreakzio denbora zehazteko instrukzioan emandako Zatikatze Denbora Aukeratzeko Jarraibideak eta erabili denbora puntu hau kontrol gisa, gainera erreakzio sistema 3 minutu luzatu edo laburtzeko, zatikatze denboran doikuntza zehatzagoa egiteko.

    A-3

    DNAren tamaina banaketa anormala zatikatze tratamenduaren ondoren

    a) Zatikatze erreaktiboaren desizozketa metodo okerra edo erreaktiboa ez da erabat nahastu desizoztu ondoren. 5 × Fragmentazio entzima nahasketa erreaktiboa izoztu gainean desizoztu. Desizoztu ondoren, nahastu erreaktiboa modu uniformean hodiaren hondoa astiro astinduz. Ez eman erreaktiboa zurrunbilo!

    b) DNA sarrerako laginak EDTA edo beste kutsatzaile batzuk ditu Gatz ioiak eta agente kelanteen agortzea DNA arazteko urratsean oso garrantzitsua da esperimentuak arrakasta izan dezan. DNA 1 × TEn disolbatzen bada, erabili instrukzioan emandako metodoa zatikatzea egiteko. Disoluzioaren EDTA kontzentrazioa ziurra bada, gomendagarria da DNA araztea eta ur desionizatuetan disolbatzea ondorengo erreakzioa lortzeko.

    c) Hasierako DNAren zenbaketa zehaztugabea Zatikatutako DNAren tamaina ADN sarrera kopuruarekin oso lotuta dago. Zatikatze tratamenduaren aurretik, Qubit, Picogreen eta beste metodo batzuen bidez DNAren kuantifikazio zehatza ezinbestekoa da erreakzio sisteman DNA kopuru zehatza zehazteko.

     d) Erreakzio-sistema prestatzeak ez ditu jarraibideak betetzen. Zatikatutako erreakzio-sistemaren prestakuntza izotz gainean burutu behar da argibideen arabera zorrozki. Efektu onena bermatzeko, erreakzioaren osagai guztiak izotz gainean jarri behar dira eta erreakzio-sistemaren prestaketa erabat hoztu ondoren egin behar da. Prestaketa amaitu ondoren, sakatu edo pipeta egin ondo nahasteko. Ez zurrunbilo!

    G: Ohar garrantzitsuak TIANSeq DirectFast DNA Library Kit (Illumina) (4992259/4992260)

    1. Nahasteko metodo okerrak (zurrunbiloak, oszilazio bortitzak, etab.) Liburutegiaren zatien banaketa anormala eragingo du (hurrengo irudian agertzen den moduan), eta horrela liburutegiaren kalitateari eragingo dio. Hori dela eta, Fragmentation Mix erreakzio disoluzioa prestatzerakoan, pipeteatu astiro-astiro gora eta behera nahasteko, edo erabili hatz-muturra berdintzeko eta nahastu. Kontuz zurrunbiloarekin ez nahastu.

    excel

    2. Garbitasun handiko DNA erabili behar da liburutegiak eraikitzeko

    ■ DNAren osotasun ona: elektroforesi banda 30 kb baino gehiago da, ilararik gabe

    ■ OD260 / 230:> 1,5

    ■ OD260 / 280: 1.7-1.9

    3. DNA sarrera kantitatea zehatza izan behar da Nanodrop baino, Qubit eta PicoGreen metodoak erabiltzea gomendatzen da DNA kuantifikatzeko.

    4. EDTAren edukia DNA soluzioan zehaztu behar da EDTAk eragin handia du zatikatze erreakzioan. EDTAren edukia handia bada, DNAren arazketa egin behar da ondorengo probaren aurretik.

    5. Zatikatze erreakzioaren soluzioa izotz gainean prestatu behar da. Zatikatze prozesua erreakzioaren tenperatura eta denborarekiko sentikorra da (batez ere indartzailea gehitu ondoren). Erreakzio denboraren zehaztasuna ziurtatzeko, prestatu erreakzio sistema izotz gainean.

    6. Zatikatzearen erreakzio-denborak zehatza izan behar du Zatikatze-urratsaren erreakzio-denborak zuzenean eragingo du zatiaren produktuen tamainan, eta, horrela, liburutegian DNA zatien tamaina banaketan eragina izango du.

    Q: ohar garrantzitsuak TIANSeq Fast RNA Library Kit (Illumina) (4992375/4992376)

    1. Zer lagin mota da kit honi aplikagarria?

    Kit honen lagin mota aplikagarria RNA osoa edo ARNm araztua izan daiteke RNA osotasun onarekin. Liburutegia eraikitzeko RNA osoa erabiltzen bada, rRNA agortzeko kit-a erabiltzea gomendatzen da (Cat # 4992363/4992364/4992391) lehenik rRNA kentzeko.

    2. FFPE laginak erabil daitezke kit honekin liburutegia eraikitzeko?

    FFPE laginetan mRNA neurri batean degradatuko da, osotasun nahiko baxuarekin. Liburutegia eraikitzeko kit hau erabiltzerakoan, zatikatze denbora optimizatzea gomendatzen da (zatikatze denbora laburtzea edo zatikatzea ez egitea).

    3. Produktuaren eskuliburuan emandako tamaina hautatzeko urratsa erabiliz, zerk eragin dezake txertatutako segmentuak desbideratze txikia izatea?

    Tamaina hautatzea produktuaren eskuliburu honetako tamaina hautatzeko urratsarekin bat etorriz egingo da. Desbideratzerik badago, arrazoia izan daiteke aleak magnetikoak giro-tenperaturara orekatuta ez egotea edo guztiz nahastuta ez egotea, pipeta ez dela zehatza edo likidoa puntan geratzea. Gomendagarria da esperimenturako adsortzio txikiko aholkuak erabiltzea.

    4. Liburutegien eraikuntzan egokitzaileen hautaketa

    Liburutegiaren eraikuntza-kitak ez du egokitzaile erreaktiborik eta gomendatzen da kit hau TIANSeq Index bakarreko egokitzailearekin (Illumina) batera erabiltzea (4992641/4992642/4992378).

    5. Liburutegiko QC

    Liburutegiaren detekzio kuantitatiboa: Qubit eta qPCR liburutegiaren masa-kontzentrazioa eta molar-kontzentrazioa zehazteko erabiltzen dira hurrenez hurren. Funtzionamendua produktuaren eskuliburuaren araberakoa da. Liburutegiaren kontzentrazioak NGS sekuentziazioaren baldintzak beteko ditu. Liburutegien banaketa-barrutia hautematea: Agilent 2100 Bioanalyzer erabiliz liburutegien banaketa-barrutia hautemateko.

    6. Anplifikazio zikloaren zenbakia hautatzea

    Argibideen arabera, PCR zikloen kopurua 6-12 da, eta behar den PCR ziklo kopurua laginaren sarreraren arabera hautatu behar da. Etekin handiko liburutegietan, gehiegizko anplifikazioa normalean gradu desberdinetan gertatzen da, Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzioan xede-barrutiko gailurraren ondoren gailur pixka bat handiagoa izaten da edo Qubiten detektatutako kontzentrazioa qPCR baino txikiagoa da. Anplifikazio arina fenomeno normala da, eta horrek ez ditu liburutegien sekuentziazioan eta ondorengo datuen analisian eragiten.

    7. Iltzeak Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzio profilean agertzen dira

    Agilent 2100 Bioanalizatzaileen detekzioan puntuen agerpena laginen zatikatze desorekatuagatik gertatzen da, non tamaina jakin bateko zati gehiago egongo diren, eta hori agerikoagoa izango da PCR aberastu ondoren. Kasu honetan, tamaina hautatzea ez egitea gomendatzen da, hau da, zatikatze baldintza 94 ° C-tan jartzea 15 min inkubatuta, non zatien banaketa txikia eta kontzentratua den eta homogeneotasuna hobetu daitekeen.

    Idatzi hemen zure mezua eta bidali iezaguzu