2 × Pfu PCR Mix

A-1 txantiloia

■ Txantiloiak proteinen ezpurutasunak edo Taq inhibitzaileak ditu, etab. —— ADN txantiloia araztu, proteinen ezpurutasunak kendu edo txantiloia DNA atera arazketa kitekin.

■ Txantiloiaren desnaturalizazioa ez da osoa —— Desnaturalizazio tenperatura egoki handitu eta desnaturalizazio denbora luzatu.

■ Txantiloiaren degradazioa ——Berriz prestatu txantiloia.

A-2 Primer

■ Primeren kalitate txarra —— Primera berriro sintetizatu.

■ Primerraren degradazioa ——Aliquot kontzentrazio handiko primerak bolumen txikian kontserbatzeko. Saihestu izozte eta desizozte ugari edo epe luzeko 4 ° C kriokontserbatuak.

■ Primerren diseinu desegokia (adibidez, primeraren luzera ez da nahikoa, primeren artean sortutako dimeroa, etab.) -Prendiseinatu primerak (primeraren dimerra eta bigarren mailako egitura sortzea saihestu)

A-3 Mg²⁺kontzentrazioa

■ Mg²⁺ kontzentrazioa baxuegia da ——Mg behar bezala handitu²⁺ kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-4 Tenplatze tenperatura

■ Beroketa tenperatura altuak primeraren eta txantiloiaren loturan eragiten du. ——Erriztura tenperatura murriztu eta egoera optimizatu 2 ° C-ko gradientearekin.

A-5 Luzapen denbora

■ Luzapen denbora laburra —— Luzapen denbora handitu.

Fenomenoak: lagin negatiboek xede sekuentzia bandak ere erakusten dituzte.

A-1 PCR kutsadura

■ Helburu sekuentziaren edo anplifikazio produktuen kutsadura gurutzatua —— Kontuz sekuentzia xede duen lagina lagin negatiboan pipeta ez dadin edo isuri zentrifugazio hoditik. Erreaktiboak edo ekipoak autoklabatu egin beharko lirateke lehendik dauden azido nukleikoak ezabatzeko, eta kutsaduraren existentzia kontrol negatiboen esperimentuen bidez zehaztu beharko litzateke.

■ Erreaktiboen kutsadura ——Alikotatu erreaktiboak eta gorde tenperatura baxuan.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ kontzentrazioa baxuegia da ——Mg behar bezala handitu²⁺ kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

■ Primer diseinu okerra, eta xede sekuentziak homologia du xede ez den sekuentziarekin. ——Riseinatu primerak.

Fenomenoak: PCR anplifikazio bandak ez datoz bat espero zen tamainarekin, handiak edo txikiak, edo batzuetan anplifikazio banda zehatzak eta anplifikazio banda ez espezifikoak gertatzen dira.

A-1 Primer

■ Primer espezifikotasun eskasa

——Riseinatu primer.

■ Primer kontzentrazioa altuegia da ——Naturazio tenperatura behar bezala handitu eta desnaturalizazio denbora luzatu.

A-2 Mg²⁺ kontzentrazioa

■ Mg²⁺ kontzentrazioa altuegia da ——Mg2 + kontzentrazioa behar bezala murriztu: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-3 Polimerasa termoestagarria

■ Gehiegizko entzima kantitatea —— Enzima kantitatea egoki murriztu 0,5 U-ko tarteetan.

A-4 Tenplatze tenperatura

■ Beroketa tenperatura baxuegia da ——Berriztaketa tenperatura egoki handitu edo bi etapetako beroketa metodoa hartu.

A-5 PCR zikloak

■ PCR ziklo gehiegi —— PCR ziklo kopurua murriztu.

A-1 Primer——Espezifizitate eskasa ——Mapa berriz diseinatu, primeraren posizioa eta luzera aldatu, bere espezifikotasuna hobetzeko; edo egin habiaratutako PCRa.

A-2 txantiloiaren DNA

——Txantila ez da purua—— Plantila araztu edo DNA atera arazketa kitekin.

A-3 Mg²⁺ kontzentrazioa

——Mg²⁺ kontzentrazioa altuegia da ——Mg behar bezala murriztu²⁺ kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-4 dNTP

——DNTPen kontzentrazioa altuegia da ——DNTPren kontzentrazioa egoki murriztu

A-5 Errekurtso tenperatura

——Tiratze tenperatura baxuegia ——Tiro tenperatura behar bezala handitu

A-6 Zikloak

——Ziklo gehiegi ——Zikloaren zenbakia optimizatu

Lehenengo pausoa polimerasa egokia aukeratzea da. Taq polimerasa erregularrak ezin du zuzendu 3'-5 'exonukleasa aktibitatea falta delako eta ez datoz bat zatien luzapenaren eraginkortasuna asko murriztuko du. Hori dela eta, Taq polimerasa erregularrak ezin ditu 5 kb baino handiagoak diren xede zatiak handitu. Aldaketa berezia duen Taq polimerasa edo fideltasun handiko beste polimerasa hautatu behar da luzapenaren eraginkortasuna hobetzeko eta zati luzeko anplifikazioaren beharrak asetzeko. Gainera, zati luzeen anplifikazioak primeraren diseinua, desnaturalizazio denbora, luzapen denbora, buffer pH-a eta abar egokitzea ere eskatzen du. Normalean, 18-24 bp-ko primerek errendimendu hobea izan dezakete. Txantiloiaren kalteak ekiditeko, 94 ° C-ko desnaturalizazio-denbora 30 segundotan edo gutxiagora murriztu behar da ziklo bakoitzeko, eta tenperatura 94 ° C-ra igotzeko anplifikazioa egin aurretik minutu 1 baino gutxiago izan behar da. Gainera, luzapen-tenperatura 68 ° C-tan kokatzeak eta luzapen-denbora 1 kb / min-ko abiaduraren arabera diseinatzeak zati luzeen anplifikazio eraginkorra ziurtatu dezake.

PCR anplifikazioaren errore tasa murriztu daiteke fideltasun handiko DNA polimerasasa desberdinak erabiliz. Orain arte aurkitutako Taq DNA polimerasa guztien artean, Pfu entzimak du errore-tasarik txikiena eta fideltasun handiena duena (ikusi erantsitako taula). Entzimak hautatzeaz gain, ikertzaileek PCR mutazio tasa murriztu dezakete erreakzio baldintzak optimizatuz, buffer konposizioa optimizatuz, polimerasa termoegonkorraren kontzentrazioa eta PCR ziklo kopurua optimizatuz.