Blood Direct PCR Kit

Helburuko genearen anplifikazio azkarra zuzenean odola erauzi gabe plantilla gisa erabiliz.

Kit honek ADN polimerasa inhibitzaile genetikoki diseinatua hartzen du, kopia bakarreko geneak gizakiaren genoman modu eraginkorrean anplifikatzeko. Kit honetan ondo optimizatutako buffer sistemak polimerasak PCR inhibitzaileen inhibizioari aurre egiten laguntzen dio eta, horrela, DNA zuzenean anplifika dezake odola eta kultibatutako zelulak txantiloi gisa erabiliz. Produktu hau erabiltzeko erraza da eta ez ditu urrats korapilatsuak eskatzen, hala nola, DNAren arazketa edo laginen aurretratamendua.
Kit hau 2 × MasterMix gisa ematen da, eta erreakzioa odol-txantiloia eta dagozkion detekzio-primerak gehituz egin daiteke. Ugaztunen zelula kultiboetan aplika daiteke, hala nola gizakiak, saguak, txerriak, behi azienda eta beste espezie batzuetan, baita odol oso fresko edo 4 ℃ kriopreserbatu ere, antikoagulatzailea (EDTA, zitratoa, heparina), odol-koagulu likidotuak eta odol-orban lehorrak. Whatman 903 eta FTA Elute txartel komertzialetan gordeta.

Katua. Ez	Enbalatzeko neurria
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Bidali mezu elektronikoa

Produktuaren xehetasuna

Adibide esperimentala

ohiko galderak

Produktuen etiketak

Ezaugarriak

■ Erraza eta azkarra: PCR anplifikazioa zuzenean egin daiteke odola txantiloitzat hartuta, laginak prestatzeko eta DNA erauzteko pauso neketsuen beharrik gabe.
■ Garbitasun handia: laginak aurrez tratatzeko eta DNA erauzteko urratsak saltatzeak laginen kutsadura gurutzatua saihesten lagun dezake.
■ Errendimendu handia: eskala handiko laginen PCR identifikazioa kit-a 96/384 putzuko PCR plakekin konbinatuz egin daiteke.
■ Unibertsaltasun sendoa: kit honek GC zati handiak edo bigarren mailako egitura konplexua duten zatiak anplifikatu ditzake, eta anplifikazio-luzera 5 kb artekoa izan daiteke.
■ Estresarekiko erresistentzia handia: kit hau modu desberdinetan kontserbatutako hainbat espezie eta odol laginetan aplika daiteke.

Aplikazioak

Kit honen PCR produktuek "A" dute 3'-muturrean, zuzenean TA bektorearen klonaziorako erabil daitekeena. Kit hau ADN genomikoaren zatiak anplifikatzeko, errendimendu handiko analisi genetikoa eta genotipatze (esaterako, geneen detekzioa) analisietarako erabil daiteke.

Produktu guztiak ODM / OEMrako pertsonaliza daitezke. Xehetasunak lortzeko,mesedez sakatu Zerbitzu pertsonalizatua (ODM / OEM)

Aurreko: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR Kit

Hurrengoa: Saguaren Ehun Zuzeneko PCR Kit

	Giza EDTA antikoagulazioa txantiloi gisa erabiliz, GC eduki ezberdineko 4 gene anplifikatu ziren Blood Direct PCR Kit bidez. PCR erreakzio sistema 20 μl zen, eta 1 μl odol erabili zen txantiloi gisa. M: TIANGEN Markatzailea II; 1: zatiaren tamaina 1090 bp, GC edukia% 68,1; 2: zatiaren tamaina 1915 bp, GC edukia% 70,4; 3: Fragmentuaren tamaina 448 bp, GC edukia% 74,8; 4: zatiaren tamaina 1527 bp, GC edukia% 61,5. Emaitza esperimentalak: Blood Direct PCR Kit-ek GC edukia duten DNA zatiak handitu ditzake% 61,5-74,8 bitartekoa, GC altuko zatiak anplifikatzeko gai dela iradokiz.
	Gizakien EDTA antikoagulazioa txantiloi gisa erabiliz, luzera desberdineko 5 gene (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 eta Hn4.0) Odol Zuzeneko PCR Kitaren bidez anplifikatu ziren. PCR erreakzio sistema 20 μl zen, eta 1 μl odol erabili zen txantiloi gisa. M: TIANGEN Markatzailea II; 1-3: 3 odol lagin desberdin; NTC: inprimagailurik gabeko kontrola. Emaitza esperimentalak: Blood Direct PCR Kit-ek zatiak 4 kb-ra arteko luzera izan dezake, zati luzeak anplifikatzeko gai dela iradokiz.
	Giza EDTA antikoagulazioa txantiloi gisa erabiliz, Blood Direct PCR Kit erabili zen odol lagin desberdinak PCR antzemateko. PCR erreakzio sistema 20 μl zen, eta 1 μl odol erabili zen txantiloi gisa. M: TIANGEN Markatzailea II; 1-9: odol karga kopurua 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl eta 5 μl da, hurrenez hurren; NTC: txantiloirik gabeko kontrola Emaitza esperimentalak: Blood Direct PCR Kit-ek odolarekiko erresistentzia handia du eta odol laginak handitu ditzake 0,1-5 μl-ko karga-tartearekin.
	Tratamendu desberdinak dituzten gizaki, arratoi, oilasko eta beste espezie batzuetako odol laginak erabili ziren txantiloi gisa. Blood Direct PCR Kit PRNP (gizakia, 750 bp), Actin (arratoia, 200 bp) eta β-Actin (Oilaskoa, 1,0 kb) anplifikatzeko erabili zen. PCR erreakzio sistema 20 μl zen, eta 1 μl odol erabili zen txantiloi gisa. M: TIANGEN Markatzailea II. Emaitza esperimentalak: odol zuzeneko PCR kitak lagin ugaritan aplika daitezke, eta zuzeneko PCR detekzioa tratamendu desberdineko hainbat espezietako odol laginetan egin daiteke.

G: anplifikazio bandarik ez

A-1 txantiloia

■ Txantiloiak proteinen ezpurutasunak edo Taq inhibitzaileak ditu, etab. —— ADN txantiloia araztu, proteinen ezpurutasunak kendu edo txantiloia DNA atera arazketa kitekin.

■ Txantiloiaren desnaturalizazioa ez da osoa —— Desnaturalizazio tenperatura egoki handitu eta desnaturalizazio denbora luzatu.

■ Txantiloiaren degradazioa ——Berriz prestatu txantiloia.

A-2 Primer

■ Primeren kalitate txarra —— Primera berriro sintetizatu.

■ Primerraren degradazioa ——Aliquot kontzentrazio handiko primerak bolumen txikian kontserbatzeko. Saihestu izozte eta desizozte ugari edo epe luzeko 4 ° C kriokontserbatuak.

■ Primerren diseinu desegokia (adibidez, primeraren luzera ez da nahikoa, primeren artean sortutako dimeroa, etab.) -Prendiseinatu primerak (primeraren dimerra eta bigarren mailako egitura sortzea saihestu)

A-3 Mg²⁺kontzentrazioa

■ Mg²⁺ kontzentrazioa baxuegia da ——Mg behar bezala handitu²⁺kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-4 Tenplatze tenperatura

■ Beroketa tenperatura altuak primeraren eta txantiloiaren loturan eragiten du. ——Erriztura tenperatura murriztu eta egoera optimizatu 2 ° C-ko gradientearekin.

A-5 Luzapen denbora

■ Luzapen denbora laburra —— Luzapen denbora handitu.

G: Gezurrezko positiboa

Fenomenoak: lagin negatiboek xede sekuentzia bandak ere erakusten dituzte.

A-1 PCR kutsadura

■ Helburu sekuentziaren edo anplifikazio produktuen kutsadura gurutzatua —— Kontuz sekuentzia xede duen lagina lagin negatiboan pipeta ez dadin edo isuri zentrifugazio hoditik. Erreaktiboak edo ekipoak autoklabatu egin beharko lirateke lehendik dauden azido nukleikoak ezabatzeko, eta kutsaduraren existentzia kontrol negatiboen esperimentuen bidez zehaztu beharko litzateke.

■ Erreaktiboen kutsadura ——Alikotatu erreaktiboak eta gorde tenperatura baxuan.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ kontzentrazioa baxuegia da ——Mg behar bezala handitu²⁺ kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

■ Primer diseinu okerra, eta xede sekuentziak homologia du xede ez den sekuentziarekin. ——Riseinatu primerak.

G: anplifikazio ez espezifikoa

Fenomenoak: PCR anplifikazio bandak ez datoz bat espero zen tamainarekin, handiak edo txikiak, edo batzuetan anplifikazio banda zehatzak eta anplifikazio banda ez espezifikoak gertatzen dira.

A-1 Primer

■ Primer espezifikotasun eskasa

——Riseinatu primer.

■ Primer kontzentrazioa altuegia da ——Naturazio tenperatura behar bezala handitu eta desnaturalizazio denbora luzatu.

A-2 Mg²⁺ kontzentrazioa

■ Mg²⁺ kontzentrazioa altuegia da ——Mg2 + kontzentrazioa behar bezala murriztu: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-3 Polimerasa termoestagarria

■ Gehiegizko entzima kantitatea —— Enzima kantitatea egoki murriztu 0,5 U-ko tarteetan.

A-4 Tenplatze tenperatura

■ Beroketa tenperatura baxuegia da ——Berriztaketa tenperatura egoki handitu edo bi etapetako beroketa metodoa hartu.

A-5 PCR zikloak

■ PCR ziklo gehiegi —— PCR ziklo kopurua murriztu.

G: Patchy edo zikinkeria banda

A-1 Primer——Espezifizitate eskasa ——Mapa berriz diseinatu, primeraren posizioa eta luzera aldatu, bere espezifikotasuna hobetzeko; edo egin habiaratutako PCRa.

A-2 txantiloiaren DNA

——Txantila ez da purua—— Plantila araztu edo DNA atera arazketa kitekin.

A-3 Mg²⁺ kontzentrazioa

——Mg²⁺ kontzentrazioa altuegia da ——Mg behar bezala murriztu²⁺ kontzentrazioa: Mg optimizatu²⁺ kontzentrazioa 1 mM-tik 3 mM-ra bitarteko erreakzio batzuen bidez, 0,5 mM-ko tartearekin, Mg optimoa zehazteko²⁺ plantilla eta primer bakoitzeko kontzentrazioa.

A-4 dNTP

——DNTPen kontzentrazioa altuegia da ——DNTPren kontzentrazioa egoki murriztu

A-5 Errekurtso tenperatura

——Tiratze tenperatura baxuegia ——Tiro tenperatura behar bezala handitu

A-6 Zikloak

——Ziklo gehiegi ——Zikloaren zenbakia optimizatu

G: Zenbat DNA plantila gehitu behar da 50 μl PCR erreakzio sistema batean?

G: Nola anplifikatu zati luzeak?

Lehenengo pausoa polimerasa egokia aukeratzea da. Taq polimerasa erregularrak ezin du zuzendu 3'-5 'exonukleasa aktibitatea falta delako eta ez datoz bat zatien luzapenaren eraginkortasuna asko murriztuko du. Hori dela eta, Taq polimerasa erregularrak ezin ditu 5 kb baino handiagoak diren xede zatiak handitu. Aldaketa berezia duen Taq polimerasa edo fideltasun handiko beste polimerasa hautatu behar da luzapenaren eraginkortasuna hobetzeko eta zati luzeko anplifikazioaren beharrak asetzeko. Gainera, zati luzeen anplifikazioak primeraren diseinua, desnaturalizazio denbora, luzapen denbora, buffer pH-a eta abar egokitzea ere eskatzen du. Normalean, 18-24 bp-ko primerek errendimendu hobea izan dezakete. Txantiloiaren kalteak ekiditeko, 94 ° C-ko desnaturalizazio-denbora 30 segundotan edo gutxiagora murriztu behar da ziklo bakoitzeko, eta tenperatura 94 ° C-ra igotzeko anplifikazioa egin aurretik minutu 1 baino gutxiago izan behar da. Gainera, luzapen-tenperatura 68 ° C-tan kokatzeak eta luzapen-denbora 1 kb / min-ko abiaduraren arabera diseinatzeak zati luzeen anplifikazio eraginkorra ziurtatu dezake.

G: Nola hobetu PCRren anplifikazio fideltasuna?

PCR anplifikazioaren errore tasa murriztu daiteke fideltasun handiko DNA polimerasasa desberdinak erabiliz. Orain arte aurkitutako Taq DNA polimerasa guztien artean, Pfu entzimak du errore-tasarik txikiena eta fideltasun handiena duena (ikusi erantsitako taula). Entzimak hautatzeaz gain, ikertzaileek PCR mutazio tasa murriztu dezakete erreakzio baldintzak optimizatuz, buffer konposizioa optimizatuz, polimerasa termoegonkorraren kontzentrazioa eta PCR ziklo kopurua optimizatuz.

Idatzi hemen zure mezua eta bidali iezaguzu