FastKing RT Kit (gDNase-rekin)

A-1 RNA degradatzen da

—— Kalitate handiko RNA araztu kutsadurarik gabe. RNA ateratzen den materialak ahalik eta freskoena izan behar du RNA degradatzea ekiditeko. Aztertu RNAren osotasuna gel desnaturalizatuan RT erreakzioaren aurretik. RNA erauzi ondoren,% 100 formamidan gorde behar da. RNase inhibitzailea erabiltzen bada, berotzeko tenperaturak <45 ° C-koa izan behar du eta pH-ak 8,0 baino txikiagoa izan behar du, bestela inhibitzaileak RNase lotua askatuko du. Gainera, RNase inhibitzailea gehitu behar da ≥ 0,8 mM TDT duten soluzioetan.

A-2 RNAk alderantzizko transkripzio erreakzioen inhibitzaileak ditu

——Alderantzizko transkripzioaren inhibitzaileen artean daude SDS, EDTA, glizerina, sodio pirofosfatoa, espermidina, formamida, guanidina gatza, etab. Kontrolatu RNA laginarekin nahastu, eta alderatu etekina kontroleko RNA erreakzioarekin inhibitzaile bat dagoen ala ez egiaztatzeko. Garbitu RNA prezipitazioa% 70 (v / v) etanolarekin inhibitzaileak kentzeko.

A-3 cDNAren lehen katea sintetizatzeko erabiltzen diren primeren errekurtso nahikoa

—— Zehaztu errekuntzatzeko tenperatura egokia dela esperimentuan erabilitako primeretarako. Ausazko hexameroetarako, tenperatura 25 ° C-tan mantentzea 10 minutuz gomendatzen da erreakzioaren tenperatura iritsi aurretik. Gene espezifikoen primeretarako (GSP), saiatu beste GSP batekin edo aldatu oligo (dT) edo ausazko hexameroa.

A-4 Hasierako RNA kopuru txikia

——Zabaldu RNA kopurua. 50 ng baino gutxiagoko RNA laginetan, 0,1 μg eta 0,5 μg azetil BSA erabil daiteke lehen harizko cDNA sintesian

A-5 Xede sekuentzia ez da aztertutako ehunetan adierazten.

—— Saiatu beste ehun batzuk.

A-6 PCR erreakzioak huts egiten du

—— Bi urratseko RT-PCRrako, PCR urratseko cDNA txantiloiak ezin du erreakzio bolumenaren 1/5 baino handiagoa izan.

A-1 Primer eta txantiloien errekuperazio ez-espezifikoa

—— Primeren 3'-muturrak ez luke 2-3 dG edo dC eduki behar. Erabili Gene espezifikoen primerak lehen harizko sintesian ausazko primers edo oligo (dT) ordez. Erabili lehen zikloetan uztatzeko tenperatura altuagoa, eta gero uzteko tenperatura baxuagoa. Erabili abiarazteko Taq DNA polimerasa PCRrako erreakzioaren berezitasuna hobetzeko.

A-2 Gene espezifikoen primeren diseinu txarra

—— Jarraitu anplifikazio primeren diseinurako printzipio berdinak.

DNA genomikoarekin kutsatutako A-3 RNA

—— Tratatu RNA PCR mailako DNase I.arekin Kontrolatu erreakzioa alderantzizko transkripziorik gabe, DNAren kutsadura antzemateko.

A-4 Primer dimeroa eratzea

—— 3 'muturrean sekuentzia osagarririk gabeko primerak diseinatu.

A-5 Mg altuegia²⁺ kontzentrazioa

——Mg optimizatu²⁺ txantiloia eta primer konbinazio bakoitzeko kontzentrazioa

A-6 DNA arrotzarekin kutsatuta

—— Erabili aerosolekiko erresistenteak diren puntak eta UDG entzimak.

A-1 Lehen harizko produktuaren edukia altuegia da

——Lehuneko produktuaren kantitatea murriztu ohiko PCR erreakzio pausuan.

A-2 Primer kopuru handiegia PCR erreakzioan

—— Murriztu primer sarrera.

A-3 Ziklo gehiegi

—— PCR erreakzio baldintzak optimizatu eta PCR ziklo kopurua murriztu.

A-4 Tenperatura baxuegia

—— Handitu tenplatze tenperatura hasiera eta luzapen ez-espezifikoak ekiditeko.

A-5 DNAren DNA degradazioak sortutako oligonukleotido zatien anplifikazio ez-espezifikoa —— Kalitate handiko RNA erauzi DNA kutsatzea ekiditeko.

RT-PCR RNA transkripzioa alderantzikatu cDNA bihurtzea da, eta gero transkribatutako alderantzizko cDNA PCR erreakzioaren txantiloi gisa erabiltzea xede zatia handitzeko. Aukeratu ausazko primers, Oligo dT eta gene espezifikoen primerak esperimentuaren baldintza zehatzen arabera. Aurreko primer guztiak zelula eukariotoen mRNA motzetarako erabil daitezke ile-orratz egiturarik gabe.

Ausazko primerak: egokiak ile-orratz egitura duten RNA luzeetarako, baita mota guztietako RNA ere, hala nola rRNA, mRNA, tRNA, etab. Txantiloi bakarreko RT-PCR erreakzioetarako erabiltzen dira batez ere.

Oligo dT: egokia da PolyA buztanarekin RNArako (RNA prokariotoak, Oligo dT rRNA eukariotoak eta tRNAk ez dute PolyA isatsik). Oligo dT PolyA isatsarekin lotuta dagoenez, RNA laginen kalitatea altua izan behar da eta degradazio kopuru txikiak ere luzera osoko cDNA sintesiaren kopurua asko murriztuko du.

Gene-berariazko primerak: txantiloien sekuentziaren osagarria, helburu sekuentzia ezagutzen den egoeretarako egokia.

Bi modu daude:

1. Barne erreferentzia metodoa: teorian, cDNA luzera ezberdineko DNA zatiak dira, beraz, elektroforesiaren emaitza zikinkeria da. RNA ugaritasuna txikia bada, ez da produkturik erakutsiko elektroforesian, baina horrek ez du esan nahi PCR bidez produkturik anplifikatuko ez denik. Oro har, barne erreferentzia erabil daiteke cDNA detektatzeko. Barne erreferentziak emaitzak baldin baditu, cDNAren kalitatea funtsean bermatu daiteke (kasu batzuetan, xede genearen zatia luzeegia bada, salbuespenak egon daitezke).

2. Txantiloi honekin anplifikatutako gene ezagun bat baldin badago, gene horren primeren bidez egiaztatu daiteke. Barne erreferentziaren anplifikazioak ez du nahitaez esan nahi cDNArekin arazorik ez dagoenik. Barne erreferentziak cDNAn ugaritasuna duenez, anplifikatzeko erraza da. CDNA arrazoi desberdinengatik partzialki degradatzen bada, probabilitatearen ikuspegitik, ugaritasun txikiko xede geneen PCR emaitzek asko eragingo dute. Barne erreferentzia ugari dagoen arren, anplifikazioak ez du eraginik izango.

RNA partzialki degradatu. RNAren osotasuna eta arazketa detektatu

Espezie desberdinen RNA edukiak desberdinak izan daitezke, baina, oro har, ateratako RNA osoak 28S eta 18S bi banda argi eduki behar ditu gelaren elektroforesian, eta lehengo bandaren distirak bigarrenarenaren bikoitza izan behar du. 5S bandak RNA degradatu dela adierazten du, eta bere distira degradazio mailarekiko proportzionala da. Barne erreferentziaren anplifikazio arrakastatsuak ez du esan nahi RNArekin arazorik ez dagoenik, barne erreferentzia ugari dagoelako, RNA anplifika daiteke degradazioa larria ez den bitartean. OD₂₆₀/ OD₂₈₀espektrofotometroaren bidez neurtutako RNA puruaren erlazioak 1,9 eta 2,1 artekoa izan behar du. RNAn proteina ezpurutasun kopuru txikiak proportzioa murriztuko du. Balioa baxuegia ez den bitartean, RT ez da eragingo. RTrentzat garrantzitsuena RNAren osotasuna da.

Barne erreferentzia genearen luzapenak RT-k arrakasta izan duela adierazi dezake, baina ez dago zertan cDNA katearen kalitatearekin lotuta. Barne erreferentzia zatiak orokorrean tamaina txikikoak eta adierazpen handikoak direnez, alderantzizko transkripzioan arrakasta izatea errazagoa da. Hala ere, xede genearen tamaina eta adierazpena gene batetik bestera aldatu egiten dira. ADNc kalitatea ezin da barneko erreferentziaren arabera bakarrik juzgatu, batez ere 2 kb baino gehiagoko xede zatien kasuan.

Lagin batzuek bigarren mailako egitura konplexuak dituzte, edo GC eduki aberatsa dute edo preziatuak dira ugaritasun txikiarekin. Kasu horietan, alderantzizko transkriptasa egokia hautatu behar da xede zatiaren eta laginaren tamainaren arabera. GC eduki altua eta bigarren mailako egitura konplexua duten RNA txantiloietan, zaila da bigarren mailako egitura tenperatura baxuan irekitzea edo alderantzizko transkriptasa arruntarekin. Txantiloi hauetarako, Quant Reverse Transcriptase hauta daiteke, alderantzizko transkripzioaren errendimendua, jakina, M-MLV serieko alderantzizko transkriptasarena baino hobea baita, hainbat RNA txantiloiak modu eraginkorrean transkribatu ditzakete eta RNA transkripzioa cDNAren lehen katean gehienez ere transkribatu dezakete. Alderantzizko transkriptasa kit orokorra erabiltzerakoan, 20 μl sistemak RNA osoaren 1 μg transkripzioa modu eraginkorrean bakarrik alderantzikatu dezake. Mesedez, erreparatu kitaren gehienezko RT gaitasunari. Txantiloia gehiegi gehitzen bada, alderantzizko transkripzioak RNA ugari izango du. Hori dela eta, hobe da sistemaren gehienezko edukiera ez gainditzea.

A-1 Zehaztu RNA larria degradatzen den eta RT arrakasta duen

Orokorrean, barne erreferentzia anplifikazioaren porrotaren arrazoia RNA degradazio larriak eragiten du askotan. Beste arrazoi posible bat alderantzizko transkripzioaren porrota da. Barne erreferentzia ezin da cDNA kate bakarraren kalitatea epaitzeko estandar gisa erabili, baina alderantzizko transkripzioa arrakastatsua den ala ez jakiteko estandar gisa erabil daiteke, RNA kalitatearen arazorik ez badago. Alderantzizko transkripzio prozesuan garrantzitsuena tenperatura konstantea eta erreakzio sistema konstantea mantentzea da, erreakzioaren eraginkortasuna hobetzeko.

A-2 Zehaztu barne erreferentziako geneak anplifikatzeko primerak fidagarriak diren eta PCRan erabiltzen diren erreaktiboekin arazorik dagoen.

Kuantifikazio erlatiboa lortzeko, RNA alderantzizko transkripzioa baino lehen kuantifikatu behar da, alderantzizko transkripzio kit askotan ere beharrezkoa da, adibidez, RNA sarrera 1 μg gisa kuantifikatu behar da. Alderantziz transkribatutako cDNA disoluzio mistoa denez, RNA, oligo dT, entzima, dNTP eta DNA hondar apur bat barne, desbideratzea eragingo da, beraz, ezinezkoa da cDNA zehazki kuantifikatzea. Hori dela eta, RNA kuantifikazioa beharrezkoa da. Lagin desberdinen artean alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna berdina dela kontuan hartuta, lortutako cDNA kantitatea berdina izan beharko litzateke, eta analisi kuantitatiboak gene desberdinen adierazpen mailen konparazioa erakutsi dezake RNA oso kopuru berean. Fluoreszentzia erlatiboaren PCR kuantitatiboa egitean, baliteke cDNA kuantitatiboa ez izatea beharrezkoa alderantzizko transkripzioaren ondoren, barne erreferentzia genea erreferentzia gisa joka baitaiteke.

Batez ere geneekin erlazionatuta dago, eta zati gehienen alderantzizko transkripzioa ez da bideragarria gene gehienentzat. Lehenik eta behin, alderantzizko transkripzioaren eraginkortasuna PCR baino askoz txikiagoa da. Bigarrenik, gene askoren GC eskualde aberatsak eta bigarren mailako egiturak alderantzizko transkripzioa eta PCR mugatzen dituzte. Azkenean, PCRren fideltasuna eta anplifikazio eraginkortasuna zaila da aldi berean bermatzea. Alderantzizko transkripzio prozesuan, inork ezin du ziurtatu kopia baxuko geneentzako zati luzea lortzea, batez ere oligo dT erabiliz. GC gehiago duten 5 'UTRri dagokionez, are zailagoa da. Hori dela eta, oraindik arrazoizko metodoa da transkripzioa ausazko primerekin alderantzikatzeko, xede zatiko haustura gune naturalak aurkitzea, segmentuen bidez anplifikatzea eta, ondoren, murrizketa digestioa eta ligatzea. Oro har, zaila da 2 kb baino handiagoak diren zatiak zuzenean anplifikatzea, baina ez da beti lortzea ezinezkoa: 1. Lehenik eta behin, RNA / mRNAren osotasuna bermatzea eta TRIZOL erauzketa hobestea. 2. M-MLV RT-PCR kit zuzenean erabil daiteke. Luzatu erosketa denbora eta handitu anplifikazio prozesuan ziklo kopurua. Bestela, habiaratutako PCR aplika daiteke edo erreakzio bat edo bi egin ditzakezu PCR anplifikazio normalaren aurretik desnaturalizazio eta luzapen denbora behar bezala luzatuta, eta horrek zatiak luzatzen lagun dezake. Erreparatu polimerasaren fideltasunari. 3. Long Taq PCRan emaitza ezin hobeak lortzeko erabil daiteke. 4. Proteina adierazteko aplikazioetarako fideltasun handiko polimerasa aplikatu behar da.

TIANGENek eskaintzen duen alderantzizko transkriptasa mota daude: Quant / King RTase eta TIANScript M-MLV. Haien arteko desberdintasun nagusia txantiloi kopurua da. Quant alderantzizko transkriptasa bakarra da, Moloney murine leukemia birusetik eratorritako M-MLV arruntaren desberdina. Quant eraginkortasun handiko alderantzizko transkriptasa berria da, Escherichia coli ingeniaritzak birkonbinatuta adierazia. Quant egokia da 50 ng-2 μg RNA anplifikatzeko alderantzizko transkripzio jarduera handikoa eta etekin handiarekin. MMLV edo AMV arruntekin alderatuta, Quant-en ezaugarririk handiena da RNA txantiloiekin oso afinitate handia duela eta tenperatura altuko desnaturalizaziorik gabeko txantiloi konplexuen transkripzioa alderantzika dezakeela. GC eduki altuagoa duten txantiloietan, alderantzizko eraginkortasuna handiagoa da. Hala ere, alderantzizko transkriptasa honek RNase H jarduera du, eta horrek cDNA produktuaren luzeran eragina izan dezake (<4,5 kb-ko txantiloietarako egokia da). Alderantzizko transkripzio konbentzionalerako, TIANScript MMLV alderantzizko transkriptasa gomendatzen da. RTasa hau RNasa H jarduera oso ahula duen entzima aldatua da, egokia den cDNA sintesi luzerako (> 5 kb).

Urrats bakarreko alderantzizko transkripzioa eta PCR anplifikazioa hodi berean burutzen dira cDNA sintesiaren eta anplifikazioaren artean hodi estalkia ireki gabe, eta hori lagungarria da kutsadura murrizteko. Lortutako cDNA lagin guztiak anplifikaziorako erabiltzen direnez, sentikortasuna handiagoa da, RNA osoaren 0,01 pg gutxienez. Urrats bakarreko RTPCR arrakastatsua lortzeko, gene espezifikoen primerak cDNA sintesia abiarazteko erabiltzen dira. Bi urratseko metodoa, hau da, alderantzizko transkripzioa eta PCR anplifikazioa bi urratsetan burutzen da. Lehenik eta behin alderantzizko transkripzioa RNA txantiloitik egiten da cDNA lortzeko, eta lortutako cDNA PCR erreakzio desberdinak edo gehiago jasaten ditu. Bi urratseko metodoak oligo (dT) edo ausazko primerak erabil ditzake cDNAren lehen katearen sintesia bideratzeko, eta lagin zehatz bateko mRNA informazio guztia transkribatu dezake.