TIANSeq HiFi anplifikazio nahasketa

Gaur egun, errendimendu handiko sekuentziazio teknologia batez ere hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologian oinarritzen da. Hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologiaren irakurketaren iraupena mugatua denez, luzera osoko sekuentzia zati txikien liburutegietan zatitu behar dugu sekuentziatzeko. Sekuentziazio esperimentu desberdinen beharren arabera, normalean sekuentziazio bakarreko edo bikoitzeko sekuentziazioa aukeratu ohi dugu. Gaur egun, hurrengo belaunaldiko sekuentziazio liburutegiko DNA zatiak, normalean, 200-800 bp bitarteko tartean banatzen dira.

a) DNAk kalitate eskasa du eta inhibitzaileak ditu. Erabili kalitate handiko DNA laginak entzimen jarduera inhibitzea ekiditeko.

b) DNA lagin kopurua ez da nahikoa DNA liburutegia eraikitzeko PCRrik gabeko metodoa erabiltzen denean. Zatikatutako DNAren sarrera 50 ng baino gehiago denean, PCRrik gabeko lan-fluxua modu selektiboan egin daiteke liburutegia eraikitzeko prozesuan. Liburutegiaren kopia kopurua baxuegia bada zuzenean sekuentziatzeko, DNA liburutegia PCR bidez anplifika daiteke egokitzailea ligatu ondoren.

c) RNA kutsatzeak hasierako DNA kuantifikazio zehaztugabea ekartzen du RNA kutsadura DNA genomikoaren purifikazio prozesuan egon daiteke, eta horrek DNA zehaztugabea kuantifikatzea eta DNA karga nahikoa ekar dezake liburutegiaren eraikuntzan zehar. RNA kendu daiteke RNase-rekin tratatuz.

A-1

a) Zati txikiak (60 bp-120 bp) agertzen dira Zatiki txikiak egokitzaile zatiak edo egokitzaileek osatutako dimeroak izan ohi dira. Agencourt AMPure XP alea magnetikoekin arazketak egokitzaile zati horiek modu eraginkorrean kendu eta sekuentziazio kalitatea bermatu dezake.

b) Pieza handiak liburutegian agertzen dira PCR anplifikazioaren ondoren. Liburutegiaren DNA zatiaren tamaina 120 bp handituko da egokitzailea ligatu ondoren. Egokitzailearen loturaren ondoren ADN zatia 120 bp baino gehiago handitzen bada, gehiegizko PCR anplifikazioaren zatitxo anormalaren anplifikazioak eragin dezake. PCR zikloen kopurua murrizteak egoera ekidin dezake.

c) Liburutegiko DNA zatien tamaina anormala egokitzailea ligatu ondoren Kit honetako egokitzailearen luzera 60 bp da. Zatiaren bi muturrak egokitzaileetara lotzen direnean, luzera 120 bp-tan handituko da. Kit honek eskaintzen duen beste egokigailu bat erabiltzen baduzu, jarri harremanetan hornitzailearekin egoki den luzera bezalako informazioa emateko. Mesedez, ziurtatu esperimentuaren lan-fluxuak eta eragiketak eskuliburuan azaldutako urratsak betetzen dituztela.

d) Egokitzailea ligatu aurretik DNA zatiaren tamaina anormala Arazo honen arrazoia DNA zatitzean erreakzio baldintza okerrek eragin dezakete. Erreakzio denbora desberdinak erabili behar dira DNA sarrera desberdinetarako. DNA sarrera 10 ng baino gehiago bada, 12 minutuko erreakzio denbora optimizatzeko abiapuntu gisa aukeratzea gomendatzen dugu, eta une honetan sortutako zatien tamaina 300-500 bp bitartekoa da batez ere. Erabiltzaileek ADN zatien luzera handitu edo txikitu dezakete 2-4 minutuz beren eskakizunen arabera, beharrezko tamainarekin DNA zatiak optimizatzeko.

A-2

a) Zatikatze denbora ez da optimizatzen Zatikatutako DNA txikiegia edo handiegia bada, kontsultatu erreakzio denbora zehazteko instrukzioan emandako Zatikatze Denbora Aukeratzeko Jarraibideak eta erabili denbora puntu hau kontrol gisa, gainera erreakzio sistema 3 minutu luzatu edo laburtzeko, zatikatze denboran doikuntza zehatzagoa egiteko.

A-3

DNAren tamaina banaketa anormala zatikatze tratamenduaren ondoren

a) Zatikatze erreaktiboaren desizozketa metodo okerra edo erreaktiboa ez da erabat nahastu desizoztu ondoren. 5 × Fragmentazio entzima nahasketa erreaktiboa izoztu gainean desizoztu. Desizoztu ondoren, nahastu erreaktiboa modu uniformean hodiaren hondoa astiro astinduz. Ez eman erreaktiboa zurrunbilo!

b) DNA sarrerako laginak EDTA edo beste kutsatzaile batzuk ditu Gatz ioiak eta agente kelanteen agortzea DNA arazteko urratsean oso garrantzitsua da esperimentuak arrakasta izan dezan. DNA 1 × TEn disolbatzen bada, erabili instrukzioan emandako metodoa zatikatzea egiteko. Disoluzioaren EDTA kontzentrazioa ziurra bada, gomendagarria da DNA araztea eta ur desionizatuetan disolbatzea ondorengo erreakzioa lortzeko.

c) Hasierako DNAren zenbaketa zehaztugabea Zatikatutako DNAren tamaina ADN sarrera kopuruarekin oso lotuta dago. Zatikatze tratamenduaren aurretik, Qubit, Picogreen eta beste metodo batzuen bidez DNAren kuantifikazio zehatza ezinbestekoa da erreakzio sisteman DNA kopuru zehatza zehazteko.

 d) Erreakzio-sistema prestatzeak ez ditu jarraibideak betetzen. Zatikatutako erreakzio-sistemaren prestakuntza izotz gainean burutu behar da argibideen arabera zorrozki. Efektu onena bermatzeko, erreakzioaren osagai guztiak izotz gainean jarri behar dira eta erreakzio-sistemaren prestaketa erabat hoztu ondoren egin behar da. Prestaketa amaitu ondoren, sakatu edo pipeta egin ondo nahasteko. Ez zurrunbilo!

1. Nahasteko metodo okerrak (zurrunbiloak, oszilazio bortitzak, etab.) Liburutegiaren zatien banaketa anormala eragingo du (hurrengo irudian agertzen den moduan), eta horrela liburutegiaren kalitateari eragingo dio. Hori dela eta, Fragmentation Mix erreakzio disoluzioa prestatzerakoan, pipeteatu astiro-astiro gora eta behera nahasteko, edo erabili hatz-muturra berdintzeko eta nahastu. Kontuz zurrunbiloarekin ez nahastu.

2. Garbitasun handiko DNA erabili behar da liburutegiak eraikitzeko

■ DNAren osotasun ona: elektroforesi banda 30 kb baino gehiago da, ilararik gabe

■ OD260 / 230:> 1,5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. DNA sarrera kantitatea zehatza izan behar da Nanodrop baino, Qubit eta PicoGreen metodoak erabiltzea gomendatzen da DNA kuantifikatzeko.

4. EDTAren edukia DNA soluzioan zehaztu behar da EDTAk eragin handia du zatikatze erreakzioan. EDTAren edukia handia bada, DNAren arazketa egin behar da ondorengo probaren aurretik.

5. Zatikatze erreakzioaren soluzioa izotz gainean prestatu behar da. Zatikatze prozesua erreakzioaren tenperatura eta denborarekiko sentikorra da (batez ere indartzailea gehitu ondoren). Erreakzio denboraren zehaztasuna ziurtatzeko, prestatu erreakzio sistema izotz gainean.

6. Zatikatzearen erreakzio-denborak zehatza izan behar du Zatikatze-urratsaren erreakzio-denborak zuzenean eragingo du zatiaren produktuen tamainan, eta, horrela, liburutegian DNA zatien tamaina banaketan eragina izango du.

1. Zer lagin mota da kit honi aplikagarria?

Kit honen lagin mota aplikagarria RNA osoa edo ARNm araztua izan daiteke RNA osotasun onarekin. Liburutegia eraikitzeko RNA osoa erabiltzen bada, rRNA agortzeko kit-a erabiltzea gomendatzen da (Cat # 4992363/4992364/4992391) lehenik rRNA kentzeko.

2. FFPE laginak erabil daitezke kit honekin liburutegia eraikitzeko?

FFPE laginetan mRNA neurri batean degradatuko da, osotasun nahiko baxuarekin. Liburutegia eraikitzeko kit hau erabiltzerakoan, zatikatze denbora optimizatzea gomendatzen da (zatikatze denbora laburtzea edo zatikatzea ez egitea).

3. Produktuaren eskuliburuan emandako tamaina hautatzeko urratsa erabiliz, zerk eragin dezake txertatutako segmentuak desbideratze txikia izatea?

Tamaina hautatzea produktuaren eskuliburu honetako tamaina hautatzeko urratsarekin bat etorriz egingo da. Desbideratzerik badago, arrazoia izan daiteke aleak magnetikoak giro-tenperaturara orekatuta ez egotea edo guztiz nahastuta ez egotea, pipeta ez dela zehatza edo likidoa puntan geratzea. Gomendagarria da esperimenturako adsortzio txikiko aholkuak erabiltzea.

4. Liburutegien eraikuntzan egokitzaileen hautaketa

Liburutegiaren eraikuntza-kitak ez du egokitzaile erreaktiborik eta gomendatzen da kit hau TIANSeq Index bakarreko egokitzailearekin (Illumina) batera erabiltzea (4992641/4992642/4992378).

5. Liburutegiko QC

Liburutegiaren detekzio kuantitatiboa: Qubit eta qPCR liburutegiaren masa-kontzentrazioa eta molar-kontzentrazioa zehazteko erabiltzen dira hurrenez hurren. Funtzionamendua produktuaren eskuliburuaren araberakoa da. Liburutegiaren kontzentrazioak NGS sekuentziazioaren baldintzak beteko ditu. Liburutegien banaketa-barrutia hautematea: Agilent 2100 Bioanalyzer erabiliz liburutegien banaketa-barrutia hautemateko.

6. Anplifikazio zikloaren zenbakia hautatzea

Argibideen arabera, PCR zikloen kopurua 6-12 da, eta behar den PCR ziklo kopurua laginaren sarreraren arabera hautatu behar da. Etekin handiko liburutegietan, gehiegizko anplifikazioa normalean gradu desberdinetan gertatzen da, Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzioan xede-barrutiko gailurraren ondoren gailur pixka bat handiagoa izaten da edo Qubiten detektatutako kontzentrazioa qPCR baino txikiagoa da. Anplifikazio arina fenomeno normala da, eta horrek ez ditu liburutegien sekuentziazioan eta ondorengo datuen analisian eragiten.

7. Iltzeak Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzio profilean agertzen dira

Agilent 2100 Bioanalizatzaileen detekzioan puntuen agerpena laginen zatikatze desorekatuagatik gertatzen da, non tamaina jakin bateko zati gehiago egongo diren, eta hori agerikoagoa izango da PCR aberastu ondoren. Kasu honetan, tamaina hautatzea ez egitea gomendatzen da, hau da, zatikatze baldintza 94 ° C-tan jartzea 15 min inkubatuta, non zatien banaketa txikia eta kontzentratua den eta homogeneotasuna hobetu daitekeen.