TIANSeq Stranded RNA-Seq Kit (illumina)

RNA transkriptomaren sekuentziazio liburutegia modu eraginkorrean prestatzea.

TIANSeq Stranded RNA-Seq Kit (Illumina) da du katea berariazko transkriptoma liburutegiak prestatzeko erabiltzen den argia sekuentziazio plataformarako. Kitak tutu bateko eragiketa lan-fluxua hartzen du RNA liburutegiko prestaketa azkarra egiteko. PCR anplifikazioaren ondoren produktuak fideltasun handia du eta ez du oinarri alborapenik. Kit honen sarrera lagina rRNA kendutako RNA totalak (mRNA eta kodetzen ez duten beste RNA batzuk) edo ARN totaletik zuzenean isolatutako mRNA dira.

Katua. Ez Enbalatzeko neurria
4993007 24 rxn
4993008 96 rxn

Produktuaren xehetasuna

Adibide esperimentala

ohiko galderak

Produktuen etiketak

Ezaugarriak

■ Sekuentziazio uniformetasun ona: PCR anplifikazioaren fideltasun handia eta oinarri alderik gabe.
■ Liburutegi bihurketa eraginkortasun handia: eraginkortasun handiko liburutegiaren eraikuntza ziurtatu daiteke 1ng mRNA laginetan.
■ Funtzionamendu azkarra: liburutegia eraikitzeko prozesu osoak 5,5 ordu baino ez ditu behar.

Zehaztapena

Mota: NGS norabidezko RNA liburutegia prestatzea
Lagina: ARN osoa
Helburua: mRNA, lncRNA
Hasierako laginaren sarrera: RNA laginak guztira 10 ng-1 μg dira, eta mRNA laginena 1 ng bezain baxua da
Eragiketa denbora: 5,5-6,5 ordu
Downstream aplikazioak: Sekuentziazioa illumina plataforman.

Produktu guztiak ODM / OEMrako pertsonaliza daitezke. Xehetasunak lortzeko,mesedez sakatu Zerbitzu pertsonalizatua (ODM / OEM)


  • Aurreko:
  • Hurrengoa:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Liburutegiaren etekina alderatzeaComparison of library yield 1. irudia 1 μg gizakiaren 293T zelula osoko RNA liburutegia eraiki zen TIANSeq Stranded RNASeq Kit eta hornitzaile V, K eta N. hornitzaileekin. Emaitzak erakusten du TIANSeq Stranded RNA-Seq Kit-ek V hornitzaileak baino etekin handiagoa duela. , K eta N.
    Transkriptoma estaldura uniformeaComparison of library yield 2. irudia 1 μg gizakiaren 293T zelula osoko RNA liburutegia eraiki zen TIANSeq Stranded RNASeq Kit eta hornitzaile V, K eta N. hornitzaileekin. Emaitzak erakusten du TIANSeq Stranded RNASeq Kit-ek 5 'eta 3' bitarteko estaldura oso uniformea ​​zuela. amaiera, V hornitzailearenaren gainetik zegoena, eta errendimendua N eta K hornitzailearen produktuen antzekoa izan zen.
    Lagin sarrera aplikazio sorta zabalaComparison of library yield 3. irudia. TIANSeq Stranded RNA-Seq Kit bateragarria da 10 ng-1 μg guztira RNA sarrerarekin, eta lagin sarrera desberdinen arabera eraikitako liburutegiak koherentzia handia du. Emaitzak erakusten du liburutegien arteko gene adierazpenaren korrelazio koefizientea 0,99 gainetik iritsi zela 10 ng eta 293T zelula 1 ARN sarrera guztira, eta datuen koherentzia handia izan zen.
    G: Zein da zatien tamainen banaketa orokorra NGS liburutegian?

    Gaur egun, errendimendu handiko sekuentziazio teknologia batez ere hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologian oinarritzen da. Hurrengo belaunaldiko sekuentziazio teknologiaren irakurketaren iraupena mugatua denez, luzera osoko sekuentzia zati txikien liburutegietan zatitu behar dugu sekuentziatzeko. Sekuentziazio esperimentu desberdinen beharren arabera, normalean sekuentziazio bakarreko edo bikoitzeko sekuentziazioa aukeratu ohi dugu. Gaur egun, hurrengo belaunaldiko sekuentziazio liburutegiko DNA zatiak, normalean, 200-800 bp bitarteko tartean banatzen dira.

    excel
    G: Eraikitako liburutegiaren DNA kontzentrazioa baxua da.

    a) DNAk kalitate eskasa du eta inhibitzaileak ditu. Erabili kalitate handiko DNA laginak entzimen jarduera inhibitzea ekiditeko.

    b) DNA lagin kopurua ez da nahikoa DNA liburutegia eraikitzeko PCRrik gabeko metodoa erabiltzen denean. Zatikatutako DNAren sarrera 50 ng baino gehiago denean, PCRrik gabeko lan-fluxua modu selektiboan egin daiteke liburutegia eraikitzeko prozesuan. Liburutegiaren kopia kopurua baxuegia bada zuzenean sekuentziatzeko, DNA liburutegia PCR bidez anplifika daiteke egokitzailea ligatu ondoren.

    c) RNA kutsatzeak hasierako DNA kuantifikazio zehaztugabea ekartzen du RNA kutsadura DNA genomikoaren purifikazio prozesuan egon daiteke, eta horrek DNA zehaztugabea kuantifikatzea eta DNA karga nahikoa ekar dezake liburutegiaren eraikuntzan zehar. RNA kendu daiteke RNase-rekin tratatuz.

    G: DNA liburutegiak banda anormalak erakutsi zituen elektroforesiaren analisian.

    A-1

    a) Zati txikiak (60 bp-120 bp) agertzen dira Zatiki txikiak egokitzaile zatiak edo egokitzaileek osatutako dimeroak izan ohi dira. Agencourt AMPure XP alea magnetikoekin arazketak egokitzaile zati horiek modu eraginkorrean kendu eta sekuentziazio kalitatea bermatu dezake.

    b) Pieza handiak liburutegian agertzen dira PCR anplifikazioaren ondoren. Liburutegiaren DNA zatiaren tamaina 120 bp handituko da egokitzailea ligatu ondoren. Egokitzailearen loturaren ondoren ADN zatia 120 bp baino gehiago handitzen bada, gehiegizko PCR anplifikazioaren zatitxo anormalaren anplifikazioak eragin dezake. PCR zikloen kopurua murrizteak egoera ekidin dezake.

    c) Liburutegiko DNA zatien tamaina anormala egokitzailea ligatu ondoren Kit honetako egokitzailearen luzera 60 bp da. Zatiaren bi muturrak egokitzaileetara lotzen direnean, luzera 120 bp-tan handituko da. Kit honek eskaintzen duen beste egokigailu bat erabiltzen baduzu, jarri harremanetan hornitzailearekin egoki den luzera bezalako informazioa emateko. Mesedez, ziurtatu esperimentuaren lan-fluxuak eta eragiketak eskuliburuan azaldutako urratsak betetzen dituztela.

    d) Egokitzailea ligatu aurretik DNA zatiaren tamaina anormala Arazo honen arrazoia DNA zatitzean erreakzio baldintza okerrek eragin dezakete. Erreakzio denbora desberdinak erabili behar dira DNA sarrera desberdinetarako. DNA sarrera 10 ng baino gehiago bada, 12 minutuko erreakzio denbora optimizatzeko abiapuntu gisa aukeratzea gomendatzen dugu, eta une honetan sortutako zatien tamaina 300-500 bp bitartekoa da batez ere. Erabiltzaileek ADN zatien luzera handitu edo txikitu dezakete 2-4 minutuz beren eskakizunen arabera, beharrezko tamainarekin DNA zatiak optimizatzeko.

    A-2

    a) Zatikatze denbora ez da optimizatzen Zatikatutako DNA txikiegia edo handiegia bada, kontsultatu erreakzio denbora zehazteko instrukzioan emandako Zatikatze Denbora Aukeratzeko Jarraibideak eta erabili denbora puntu hau kontrol gisa, gainera erreakzio sistema 3 minutu luzatu edo laburtzeko, zatikatze denboran doikuntza zehatzagoa egiteko.

    A-3

    DNAren tamaina banaketa anormala zatikatze tratamenduaren ondoren

    a) Zatikatze erreaktiboaren desizozketa metodo okerra edo erreaktiboa ez da erabat nahastu desizoztu ondoren. 5 × Fragmentazio entzima nahasketa erreaktiboa izoztu gainean desizoztu. Desizoztu ondoren, nahastu erreaktiboa modu uniformean hodiaren hondoa astiro astinduz. Ez eman erreaktiboa zurrunbilo!

    b) DNA sarrerako laginak EDTA edo beste kutsatzaile batzuk ditu Gatz ioiak eta agente kelanteen agortzea DNA arazteko urratsean oso garrantzitsua da esperimentuak arrakasta izan dezan. DNA 1 × TEn disolbatzen bada, erabili instrukzioan emandako metodoa zatikatzea egiteko. Disoluzioaren EDTA kontzentrazioa ziurra bada, gomendagarria da DNA araztea eta ur desionizatuetan disolbatzea ondorengo erreakzioa lortzeko.

    c) Hasierako DNAren zenbaketa zehaztugabea Zatikatutako DNAren tamaina ADN sarrera kopuruarekin oso lotuta dago. Zatikatze tratamenduaren aurretik, Qubit, Picogreen eta beste metodo batzuen bidez DNAren kuantifikazio zehatza ezinbestekoa da erreakzio sisteman DNA kopuru zehatza zehazteko.

     d) Erreakzio-sistema prestatzeak ez ditu jarraibideak betetzen. Zatikatutako erreakzio-sistemaren prestakuntza izotz gainean burutu behar da argibideen arabera zorrozki. Efektu onena bermatzeko, erreakzioaren osagai guztiak izotz gainean jarri behar dira eta erreakzio-sistemaren prestaketa erabat hoztu ondoren egin behar da. Prestaketa amaitu ondoren, sakatu edo pipeta egin ondo nahasteko. Ez zurrunbilo!

    G: Ohar garrantzitsuak TIANSeq DirectFast DNA Library Kit (Illumina) (4992259/4992260)

    1. Nahasteko metodo okerrak (zurrunbiloak, oszilazio bortitzak, etab.) Liburutegiaren zatien banaketa anormala eragingo du (hurrengo irudian agertzen den moduan), eta horrela liburutegiaren kalitateari eragingo dio. Hori dela eta, Fragmentation Mix erreakzio disoluzioa prestatzerakoan, pipeteatu astiro-astiro gora eta behera nahasteko, edo erabili hatz-muturra berdintzeko eta nahastu. Kontuz zurrunbiloarekin ez nahastu.

    excel

    2. Garbitasun handiko DNA erabili behar da liburutegiak eraikitzeko

    ■ DNAren osotasun ona: elektroforesi banda 30 kb baino gehiago da, ilararik gabe

    ■ OD260 / 230:> 1,5

    ■ OD260 / 280: 1.7-1.9

    3. DNA sarrera kantitatea zehatza izan behar da Nanodrop baino, Qubit eta PicoGreen metodoak erabiltzea gomendatzen da DNA kuantifikatzeko.

    4. EDTAren edukia DNA soluzioan zehaztu behar da EDTAk eragin handia du zatikatze erreakzioan. EDTAren edukia handia bada, DNAren arazketa egin behar da ondorengo probaren aurretik.

    5. Zatikatze erreakzioaren soluzioa izotz gainean prestatu behar da. Zatikatze prozesua erreakzioaren tenperatura eta denborarekiko sentikorra da (batez ere indartzailea gehitu ondoren). Erreakzio denboraren zehaztasuna ziurtatzeko, prestatu erreakzio sistema izotz gainean.

    6. Zatikatzearen erreakzio-denborak zehatza izan behar du Zatikatze-urratsaren erreakzio-denborak zuzenean eragingo du zatiaren produktuen tamainan, eta, horrela, liburutegian DNA zatien tamaina banaketan eragina izango du.

    Q: ohar garrantzitsuak TIANSeq Fast RNA Library Kit (Illumina) (4992375/4992376)

    1. Zer lagin mota da kit honi aplikagarria?

    Kit honen lagin mota aplikagarria RNA osoa edo ARNm araztua izan daiteke RNA osotasun onarekin. Liburutegia eraikitzeko RNA osoa erabiltzen bada, rRNA agortzeko kit-a erabiltzea gomendatzen da (Cat # 4992363/4992364/4992391) lehenik rRNA kentzeko.

    2. FFPE laginak erabil daitezke kit honekin liburutegia eraikitzeko?

    FFPE laginetan mRNA neurri batean degradatuko da, osotasun nahiko baxuarekin. Liburutegia eraikitzeko kit hau erabiltzerakoan, zatikatze denbora optimizatzea gomendatzen da (zatikatze denbora laburtzea edo zatikatzea ez egitea).

    3. Produktuaren eskuliburuan emandako tamaina hautatzeko urratsa erabiliz, zerk eragin dezake txertatutako segmentuak desbideratze txikia izatea?

    Tamaina hautatzea produktuaren eskuliburu honetako tamaina hautatzeko urratsarekin bat etorriz egingo da. Desbideratzerik badago, arrazoia izan daiteke aleak magnetikoak giro-tenperaturara orekatuta ez egotea edo guztiz nahastuta ez egotea, pipeta ez dela zehatza edo likidoa puntan geratzea. Gomendagarria da esperimenturako adsortzio txikiko aholkuak erabiltzea.

    4. Liburutegien eraikuntzan egokitzaileen hautaketa

    Liburutegiaren eraikuntza-kitak ez du egokitzaile erreaktiborik eta gomendatzen da kit hau TIANSeq Index bakarreko egokitzailearekin (Illumina) batera erabiltzea (4992641/4992642/4992378).

    5. Liburutegiko QC

    Liburutegiaren detekzio kuantitatiboa: Qubit eta qPCR liburutegiaren masa-kontzentrazioa eta molar-kontzentrazioa zehazteko erabiltzen dira hurrenez hurren. Funtzionamendua produktuaren eskuliburuaren araberakoa da. Liburutegiaren kontzentrazioak NGS sekuentziazioaren baldintzak beteko ditu. Liburutegien banaketa-barrutia hautematea: Agilent 2100 Bioanalyzer erabiliz liburutegien banaketa-barrutia hautemateko.

    6. Anplifikazio zikloaren zenbakia hautatzea

    Argibideen arabera, PCR zikloen kopurua 6-12 da, eta behar den PCR ziklo kopurua laginaren sarreraren arabera hautatu behar da. Etekin handiko liburutegietan, gehiegizko anplifikazioa normalean gradu desberdinetan gertatzen da, Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzioan xede-barrutiko gailurraren ondoren gailur pixka bat handiagoa izaten da edo Qubiten detektatutako kontzentrazioa qPCR baino txikiagoa da. Anplifikazio arina fenomeno normala da, eta horrek ez ditu liburutegien sekuentziazioan eta ondorengo datuen analisian eragiten.

    7. Iltzeak Agilent 2100 Bioanalyzer-en detekzio profilean agertzen dira

    Agilent 2100 Bioanalizatzaileen detekzioan puntuen agerpena laginen zatikatze desorekatuagatik gertatzen da, non tamaina jakin bateko zati gehiago egongo diren, eta hori agerikoagoa izango da PCR aberastu ondoren. Kasu honetan, tamaina hautatzea ez egitea gomendatzen da, hau da, zatikatze baldintza 94 ° C-tan jartzea 15 min inkubatuta, non zatien banaketa txikia eta kontzentratua den eta homogeneotasuna hobetu daitekeen.

    Idatzi hemen zure mezua eta bidali iezaguzu